觀察異補骨脂素體外對HepG2細胞毒性和細胞內膽汁酸濃度的影響論

　　異補骨脂素是一種呋喃香豆素類成分，存在于補骨脂等多種藥材中，2010藥典中將異補骨脂素及其同分異構體補骨脂素作為藥材補骨脂(PsoraleacorylifoliaL.)的質量控制成分。補骨脂可用于治療更年期綜合征、骨質疏松等，其中異補骨脂素有雌激素樣作用，可選擇性作用于雌激素受體α，可以促進成骨細胞分化成熟，有利于骨質疏松的治療，是補骨脂中一種有效成分。近年來發現臨床中補骨脂及其相關制劑可能導致肝損害并有膽汁淤積的表現，而動物實驗發現異補骨脂素、補骨脂素、異補骨脂苷、補骨脂苷為主要成分的補骨脂水提物有明顯肝毒性，更有研究表明異補骨脂素和補骨脂素對小鼠肝功能有一定影響，這提示補骨脂導致的膽汁淤積性肝損害現象可能與異補骨脂素和補骨脂素有關。更進一步推測就是異補骨脂素和補骨脂素干擾了膽汁酸的正常合成轉運，從而導致膽汁淤積的發生。肝細胞膜上的與膽汁酸轉運相關的轉運體，這些酶和轉運體在膽汁酸的合成轉運中起到重要的作用，并且肝細胞內存在FXR(法尼醇X受體，farne瞫oidXreceptor)、PXR(孕烷X受體，pregnaneXre瞔eptor)等受體可以調節相關酶和轉運體[9-10]。本研究考察了異補骨脂素作用24h后HepG2細胞中相關酶、轉運體等mRNA的變化，以了解異補骨脂素對于膽汁酸合成轉運的影響，為解釋異補骨脂素在膽汁酸淤積中的作用機制、以及更進一步也闡明補骨脂毒性提供基礎。

　　1 材料

　　1.1 受試藥

　　異補骨脂素購自天津市月牙湖科技有限公司，經HPLC檢測純度大于95%。

　　1.2 細胞

　　HepG2細胞，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

　　1.3 試劑與儀器

　　DMEM培基和無血清Opti睲EM培基，胎牛血清(FBS)為Gibco產品;青霉素-鏈霉素雙抗、胰酶、DMSO、DEPC水為北京索萊寶產品;PBS為武漢博士德產品;TRIzol為Invitrogen產品;RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit為Fermen瞭as產品;Hotstartfluo睵CRmixSYBRGreenⅠ(2×)為上海生工產品;BCA蛋白檢測試劑盒為Ther瞞o產品;總膽汁酸(TBA)試劑盒為中生北控產品;其它化學試劑為國產分析純。Hitachi7020全自動生化儀;PerkinElmerEn瞫pire多功能讀板機;ThermoStratos離心機;Bio睷adCFX96型熒光定量PCR儀;OlympusBX51型倒置熒光顯微鏡及成像系統;上海世平SPH103B恒溫振蕩器。

　　2 方法

　　2.1 細胞培養

　　HepG2細胞培養于含10% 的FBS、1%雙抗的DMEM的培基中，置37℃、5% CO2的孵箱中進行培養。細胞貼壁24h，每48h換液1次，先用無菌PBS洗細胞3次，再加0.25%的胰酶消化。細胞懸液離心(1000r·min-1，4℃，10min)后棄上清，加入含10% FBS的完全培養基，反復吹打細胞至單細胞懸液，進行傳代和種板。

　　2.2 細胞活力和細胞中膽汁酸檢測

　　HepG2細胞按每孔1×104個細胞接種于96孔板中，在37℃、5% CO2條件下培養24h貼壁后，分別給予用Opti睲EM培基稀釋的終濃度為6.25、25、100、400μmol·L-1的異補骨脂素，作用24h后移除培養基，加10μLMTT溶液(5g·L-1)溫箱孵育4h，移除上清每孔加入100μL的DMSO，振蕩10min后在490nm處測得吸光度值。計算細胞存活率(相對于對照組)。HepG2細胞按每孔1×105 個接種于24孔板中，在37℃、5% CO2條件下培養24h貼壁后，分別給予用Opti睲EM培基稀釋的'終濃度為6.25、25、100、400μmol·L-1的異補骨脂素，作用24h后移除培養基，加入PBS緩沖液100μL，用細胞刮刀刮取細胞，細胞用超聲破碎細胞，BCA法檢測細胞破碎液的蛋白濃度，并在全自動生化儀檢測TBA。

　　2.3 RealtimePCR檢測

　　HepG2細胞按每孔5×105個接種于6孔板，于37℃、5% CO2培養箱中培養24h，然后給予異補骨脂素(25、100μmol·L-1，Opti睲EM培基稀釋)處理24h。去除培養液，用PBS洗細胞3次。用TRIzol常規提取HepG2細胞中總RNA，-80℃保存。紫外分光光度法檢測RNA__樣品的純度與濃度。按反轉錄試劑盒要求進行反轉錄，realtimePCR反應體系20μL，其中cDNA樣本1μL，上、下游引物各0.5μL，HotstartFluo睵CRmix試劑10μL，無RNA酶水8μL。在94℃預變性4min，每個循環94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共40個循環。取2-△△CT值進行數據統計。

　　2.4 統計學處理

　　實驗數據以珋x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

　　3 結果

　　3.1 對HepG2細胞增殖及細胞內膽汁酸的影響

　　異補骨脂素作用于HepG2細胞24h，6.25μmol·L-1異補骨脂素即對HepG2細胞增殖有一定抑制作用，細胞相對存活率為92.8%。在625～400μmol·L-1范圍內隨著異補骨脂素的濃度升高、細胞存活率也明顯降低，而400μmol·L-1異補骨脂素作用下細胞相對存活率僅為27.9%。異補骨脂素作用24h的IC50為118.1μmol·L-1(95%可信限107.1-130.2μmol·L-1)見Fig1A。對細胞破碎液的檢測發現，異補骨脂素作用24h后，400.0μmol·L-1的異補骨脂素處理組HepG2細胞內膽汁酸濃度升高約5倍，100.0μmol·L-1處理組的細胞內膽汁酸濃度也明顯升高，見Fig1B。

　　3.2 對膽汁酸合成轉運相關基因轉錄水平的影響

　　異補骨脂素處理24h后，HepG2細胞中BSEP、NTCP的mRNA雖然與空白相比均值有一定變化、但并無統計學意義;25μmol·L-1異補骨脂素組，HepG2細胞中MRP2、MRP3、CYP7A1的mRNA轉錄均明顯降低，而100μmol·L-1異補骨脂素組，除了MRP2、MRP3、CYP7A1的降低外，OATP2、OSTα、CYP27A1、FXR、PXR的mRNA轉錄明顯升高。

　　4 討論

　　異補骨脂素在體外HepG2細胞中作用24h的IC50為118.1μmol·L-1，但其毒性作用的最小毒性劑量很小，按實驗結果可以擬合量效方程并計算IC5僅為3.8μmol·L-1，提示異補骨脂素的安全劑量較低。

　　將細胞培養基中的藥物濃度近似為血液中的藥物濃度，可以借助于體內代謝研究結果來先對體外研究結果進行外推。大鼠代謝研究表明，大鼠口服給予香豆素混合物(相當于異補骨脂素4.39mg·kg-1)，異補骨脂素在血液中峰濃度高達37.89mg·L-1，口服的生物利用度高達70.35%。同時有研究表明異補骨脂苷在體內可以轉化為異補骨脂素，那么實際使用補骨脂時血液中異補骨脂素的來源除了異補骨脂素外還包括異補骨脂苷，這個量可達補骨脂的1%以上，按2010版藥典中補骨脂每人每天10g的使用上限，折合大鼠異補骨脂素用量9mg·kg-1。研究中的結果，大鼠血液中峰濃度可達70mg·L-1以上(超過400μmol·L-1，異補骨脂素分子量186.16)，即便是藥后24h血液中異補骨脂素濃度也在2mg·L-1以上(約10μmol·L-1大于其在HepG2細胞的IC5)。很顯然，按上述推斷異補骨脂素在體內也會導致相似的毒性，這也許可以一定程度地解釋補骨脂所導致的肝損害。

　　膽汁酸可以誘導細胞凋亡，高濃度的膽汁酸可導致動物肝損害。FXR和PXR可以通過調節膽汁酸合成轉運來對抗膽汁酸的毒性，FXR和PXR的缺失會導致膽汁酸更容易蓄積而產生毒性作用。理論上FXR的激活可以上調BSEP、OSTα/β、MRPs，下調NTCP以降低細胞內膽汁酸濃度，FXR還可下調CYP7A1以減少肝細胞內膽汁酸合成。實驗中異補骨脂素100μmol·L-1，細胞內膽汁酸濃度明顯升高，將會激活膽汁酸受體FXR、PXR，并使之上調，OSTα上調和CYP7A1下調是符合FXR預期作用的;而作為替代途徑的CYP27A1的上調可能是因為肝細胞內膽汁酸合成限速酶的CYP7A1被抑制的結果;通過發現，小鼠在膽酸的誘導下OATP2也是升高的，而且在膽酸的作用下小鼠的OATP2上調倍數明顯高于PXR-/-小鼠，盡管未用膽酸處理時野生型小鼠OATP2絕對水平低于PXR-/-小鼠肝臟中，但膽酸處理后OATP2水平反而高，提示實驗中OATP2似乎更可能是PXR的調節作用。異補骨脂素在25μmol·L-1時，細胞內膽汁酸濃度已經有所升高，但與對照之間的差異尚無統計學意義，而此時MRP2、MRP3已經明顯下調，故異補骨脂素對MRP2、MRP3的下調作用顯然早于膽汁酸的淤積，是異補骨脂素對膽汁酸轉運干預的早期作用點，而上調的OATP2和CYP27A1也許對抗了上調的OSTα和下調的CYP7A1的作用，最終導致膽汁酸在細胞內蓄積，細胞內膽汁酸的檢測也證實細胞內膽汁酸較正常升高了5倍、達到400μmol·L-1。

　　當然，體外HepG2細胞是人源腫瘤細胞，而中代謝研究是大鼠的數據，種屬不同可能導致推論有一定差異，最終異補骨脂素在體內是否會同樣影響膽汁酸合成轉運還有待于研究確證。

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